Estudio computacional de las interacciones moleculares entre el timol y los residuos HIS41 y CYS145 presentes en el sitio activo de la proteasa 3CLpro

La proteína proteasa 3CLpro del SARS-CoV-2 es una enzima crucial para la replicación viral, razón por la cual se convierte en un blanco terapéutico de gran importancia. El timol (2-isopropil-5-me-tilfenol), un compuesto natural que se encuentra en el tomillo (Thymus vulgaris), exhibe potencial actividad antiviral contra la proteasa 3CLpro. En este estudio, usando acoplamiento molecular con AutoDockTools-1.5.6, se evaluaron las energías de interacción molecular entre el timol y los residuos de aminoácidos en el sitio activo de la proteína proteasa 3CLpro. Luego, con la teoría cuántica de Átomos en Moléculas (QTAIM) y la de Interacciones no covalentes (NCI) se analizaron los tipos de interacciones moleculares entre los residuos de aminoácidos identificados y el timol. Los cálculos cuánticos se llevaron con el software Orca-5.0.3, utilizando el método DFT con el funcional M06-2X y el conjunto base aug-cc-pVDZ en fase gaseosa. Los resultados de acoplamiento molecular indican que el timol se une a la proteína 3CL con una energía de interacción igual a -3,784 kcal/mol. El análisis QTAIM indica la presencia de puntos críticos de enlace entre el timol y los residuos HIS41 y CYS145. Además, se observa la formación de un enlace de hidrógeno entre el grupo OH del timol y el residuo CYS145, lo cual es corroborado por los análisis ELF (Electron Localization Function) y NCI (Non Covalent Interactions). Finalmente, el método NCI confirma la presencia de interacciones de Van der Waals con el residuo HIS41. Los resultados sugieren que el mecanismo de inhibición de la actividad de la proteína 3CLpro es controlado por interacciones moleculares tipo puente de hidrógeno e interacciones débiles.

The protease 3CLpro of the SARS-CoV-2 is a crucial enzyme for viral replication, becoming a highly important therapeutic target. Thymol (2-isopropyl-5-methyl-phenol), a naturally occurring compound found in thyme, exhibits potential antiviral activity against the 3CLpro protease. In this study, using molecular docking with AutoDockTools-1.5.6, the molecular interaction energies between thymol and amino acid residues in the active site of the protein protease 3CLpro were evaluated. Then, with the Atoms in Molecules (QTAIM) and Non-covalent Interactions (NCI) theories, the types of molecular interactions between identified amino acid residues and thymol were analyzed. Quantum calculations were carried out with the Orca-5.0.3 software using the DFT method with the M06-2X functional and the aug-cc-pVDZ basis set in the gas phase. The molecular docking results indicate that thymol is linked to the 3CL protein with an interaction energy equal to -3.784 kcal/mol. QTAIM analysis indicates the presence of critical binding sites between thymol and residues HIS41 and CYS145. In addition, the formation of a hydrogen bond between the OH group of thymol and the CYS145 residue is observed, which is corroborated by the ELF and NCI analyses. Finally, the NCI method confirms the presence of Van der Waals interactions with the HIS41 residue. The results suggest that the mechanism of inhibition of the activity of the 3CLpro protein is controlled by molecular interactions such as hydrogen bonding and weak interactions.

A protease 3CLpro do SARS-CoV-2 é uma enzima crucial para a replicação viral, tornando-se um alvo terapêutico de grande importÅncia. O timol (2-isopropil-5-me-tilfenol), um composto natural encontrado no tomilho, exibe potencial atividade antiviral contra a protease 3CLpro. Neste estudo, utilizando o docking molecular com o AutoDockTools-1.5.6, foram avaliadas as energias de interação molecular entre o timol e os residuos de aminoácidos no sítio ativo da proteína protease 3CLpro. Em seguida, com a teoria quantica de atomos em moleculas (QTAIM) e da interacões no-covalentes (NCI), foram analisados os tipos de interações moleculares entre os resíduos de aminoácidos identificados e o timol. Os cálculos quÅnticos foram realizados com o software Orca-5.0.3 usando o método DFT com o funcional M06-2X e a base aug-cc-pVDZ definida na fase gasosa. Os resultados do docking molecular indicam que o ti-mol está ligado à proteína 3CL com uma energia de interação igual a -3.784 kcal/ mol. A análise QTAIM indica a presença de sítios de ligação críticos entre o timol e os resíduos HIS41 e CYS145. Além disso, observa-se a formação de uma ponte de hidrogênio entre o grupo OH do timol e o resíduo CYS145, o que é corroborado pelas análises ELF e NCI. Finalmente, o método NCI confirma a presença das interações de Van der Waals com o resíduo HIS41. Os resultados sugerem que o mecanismo de inibição da atividade da proteína 3CLpro é controlado por interações moleculares como ligações de hidrogênio e interações fracas.

Effect of cadmium chloride toxicity on olfactory mucosa / Efecto de la toxicidad del cloruro de cadmio en la mucosa olfativa

SUMMARY: Cadmium is a highly toxic metal and affects the respiratory mucosa. The aim of the study is to show the inflammation and degenerative effect of cadmium on the olfactory mucosa. In this study, eight-week-old Wistar rats with an average weight of 170-190 g were divided into two groups (control and experiment) with 20 animals in each group and used in the experiments. The rats in the experimental group were given 2 mg/kg/day powdered cadmium chloride dissolved in water intraperitoneally every day for two weeks. At the end of the experiment, the nasal cavity was completely removed with anesthesia. Concha nasalis superior was separated, fixed with zinc-Formalin solution and decalcified with 5 % EDTA (Ethylene-diaminetetraacetic acid). After routine histopathological procedure, APAF-1 antibody was used for expression of Hematoxylin-Eosin (HE) and immunohistochemistry. Histopathological examination revealed interruptions in the basement membrane structure due to cadmium and degenerative changes in stem cells, degeneration in sensory cells and pycnosis in nuclei, dilatation in blood vessels and increased inflammation in connective tissue. APAF-1 expression was found to increase in epithelial cells and olfactory glands (Bowman gland) cells. It has been thought that cadmium toxicity increases cell degeneration and inflammation in the olfactory mucosa and may significantly affect cell death and olfactory metabolism by inducing the pro-apoptotic process.

El cadmio es un metal altamente tóxico que afecta la mucosa respiratoria. El objetivo fue mostrar el efecto inflamatorio y degenerativo del cadmio sobre la mucosa olfativa. En este estudio, ratas Wistar de ocho semanas de edad con un peso promedio de 170-190 g se dividieron en dos grupos (control y experimental) con 20 animales en cada grupo. Las ratas del grupo experimental recibieron 2 mg/kg/día de cloruro de cadmio en polvo disuelto en agua por vía intraperitoneal todos los días durante dos semanas. En los animales se exirpó la cavidad nasal bajo anestesia. Se separó la concha nasal superior, se fijó con solución de zinc-Formalina y se descalcificó con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) al 5 %. Después del procedimiento histopatológico de rutina, Hematoxilina- Eosina (HE) e inmunohistoquímica, se utilizó el anticuerpo APAF-1. El examen histopatológico reveló interrupciones en la estructura de la membrana basal debido al cadmio y cambios degenerativos en las células madre, degeneración en las células sensoriales y picnosis en los núcleos, dilatación de los vasos sanguíneos y aumento de la inflamación en el tejido conjuntivo. Se encontró que la expresión de APAF-1 aumenta en las células epiteliales y en las células de las glándulas olfatorias (glándulas de Bowman). Se ha pensado que la toxicidad del cadmio aumenta la degeneración celular y la inflamación en la mucosa olfativa y puede afectar significativamente la muerte celular y el metabolismo olfativo al inducir el proceso proapoptótico.

Inhibition by essential oils of Mentha viridis and Mentha pulegium (Lamiaceae) in proteolysis, fibrinogenolysis and coagulation caused by venomous snakes

Snake venoms are widely used as laboratory tools for studies of physiological, pharmacological and toxicological mechanisms. Venoms used here are rich sources of several classes of proteases that act on factors of the coagulation cascade, fibrinogenolysis and fibrinolysis, altering the hemostatic processes, and phospholipases A2 which are involved mainly in inflammatory and clotting processes. Natural products such as essential oils are made up of active ingredients with wide application in the food, pharmaceutical and cosmetic industries. Thus, this study evaluates the essential oils from Mentha viridis and Mentha pulegium on coagulation, fibrinogenolysis and degradation of azocasein, induced by Bothrops sp and Lachesis muta muta venoms. These oils were achieved by hydrodistillation and presented, respectively, as the main constituents linalool (40.70 %), carvone (13.52 %) and α-terpinene (8.56 %); pulegone (50.01 %), menthol (31.90 %) and menthone (16.56 %). The essential oils were previously incubated with Bothrops alternatus venom, for two different times, then plasma was added and time was recorded. The M. viridis oil presented greater anticlotting potential. Meanwhile, the M. pulegium oil presented anticlotting or proclotting activity dependent on the dose tested. The incubation time also influenced the effect of the oils on the coagulation time. At azocaseinolytic assay, the oil from M. pulegium reduced the activity for all evaluated venoms. The highest inhibition was of 39.99 %; on activity induced by B. jararacussu, M. viridis reduced the activity in 57.72 %. On B. moojeni, the major inhibition observed was of 74.67 %. The fibrinogenolysis induced by B. moojeni venom was totally inhibited by both oils in the evaluated proportions. The results show the presence in oils of protease inhibitors, considering serine and metalloproteases (acting on clotting factors or with hemorrhagic activity), as well as phospholipase A2 (enzymes involved in inflammation and clotting processes) inhibitors of wide application in medical and biotechnology areas.

Los venenos de serpientes son ampliamente utilizados como herramientas de laboratorio para estudios de mecanismos fisiológicos, farmacéuticos y toxicológicos. Los venenos son recursos ricos en diferentes clases de proteasas que actúan sobre los factores de la cascada de coagulación, fibrinogenólisis y fibrinólisis, alterando los procesos homeostáticos y las fosfolipasas A2, los cuales están involucrados en procesos inflamatorios y de coagulación. Los productos naturales como los aceites esenciales se componen de ingredientes activos de amplia aplicación en las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética. El presente estudio evalúa los aceites esenciales de Mentha viridis y Mentha pulegium sobre la coagulación, fibrinogenólisis y degradación de azocaseína, inducida por los venenos de Bothrops sp. y Lachesis muta muta. Los aceites esenciales fueron obtenidos por hidrodestilación y sus componentes principales fueron identificados respectivamente como el linalool (40.70 %), carvona (13.52 %) y α-terpineno (8.56 %); pulegone (50.01 %), mentol (31.9 %) y mentona (15.56 %). Los aceites esenciales fueron previamente incubados con veneno de Bothrops alternatus, durante dos tiempos diferentes, luego se agregó el plasma y fue registrado el tiempo. El aceite de M. viridis presentó el más grande potencial anticoagulante. Mientras tanto, el aceite de M. pulegium presentó actividad anticoagulante o procoagulante dependiendo de la dosis evaluada. El tiempo de incubación también influyó en el efecto de los aceites sobre el tiempo de coagulación. En el ensayo azocaseínolitico, el aceite de M. pulegium redujo la actividad para todos los venenos evaluados. La inhibición más alta inducida para el veneno de B. jararacussu fue de 39.99 %, para M. viridis la actividad fue reducida en 57.72 %, mientras que para B. moojeni, la mayor inhibición observada fue de 74.67 %. La fibrinogenólisis inducida por el veneno de B. moojeni fue totalmente inhibida por ambos aceites en las proporciones evaluadas. Los resultados muestran la presencia de inhibidores de proteasas en los aceites, como las serinas y metaloproteasas (actuando sobre los factores de coagulación o sobre la actividad hemorrágica), como también fosfolipasas A2 (enzimas involucradas en los procesos de inflamación y coagulación), los cuales son inhibidores de amplia aplicación en áreas médicas y biotecnológicas.

Cambios electrocardiográficos en pacientes con VIH con y sin inhibidores de proteasa vs NNRTI / Differences in electrocardiographic changes in HIV patients with and without treatment with protease inhibitors vs NNRTI

Resumen ANTECEDENTES La infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) incrementa la prevalencia de prolongación del intervalo QT corregido (QTc), lo que es un factor independiente de eventos de enfermedad cardiovascular en esta población. En la bibliografía mundial se asocia este cambio con la administración de los antirretrovirales inhibidores de proteasa y efavirenz. Sin embargo, no se conocen datos de estos cambios en la población mexicana. MATERIAL Y MÉTODO Estudio prospectivo observacional en el que se seleccionaron expedientes de marzo de 2015 a mayo de 2016 de la consulta externa del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER); se dividieron en dos grupos: sin tratamiento, por reciente diagnóstico, y con tratamiento antirretroviral. Se registraron datos clínicos, tratamiento farmacológico, electrocardiograma y química sanguínea. RESULTADOS No se encontraron diferencias entre ambos grupos respecto a edad ni electrólitos séricos. Tampoco se encontró relación entre la prolongación del QTc con efavirenz o los inhibidores de proteasa. Raltegravir disminuyó la duración del QTc (p = 0.001) mientras que la coinfección por molusco contagioso se asoció con prolongación del QTc (p = 0.02). CONCLUSIÓN En nuestro estudio no logramos demostrar en población mexicana relación de la prolongación del QTc con los antirretrovirales de primera ni segunda línea. Se requieren más estudios para determinar la importancia clínica del efecto de raltegravir y molusco contagioso en el QTc.

Abstract BACKGROUND Human immunodeficiency virus (HIV) infection increases the prevalence of QTc prolongation (QTc), which is an independent factor of cardiovascular disease events in this population. In the world literature this change is associated with the use of the protease inhibitors and efavirenz antiretrovirals. However, no data are available on these changes in the Mexican population. MATERIAL AND METHOD A prospective observational study was done selecting records from March 2015 to May 2016 of the external consultation of the National Institute of Respiratory Diseases (INER), Mexico City; they were divided into two groups, those without treatment, because recent diagnosis, and with antiretroviral treatment. We recorded clinical data, pharmacological treatment, electrocardiogram and blood chemistry. RESULTS We found no differences between the two groups regarding age or serum electrolytes. We found no association between QTc prolongation and efavirenz or protease inhibitors. Raltegravir decreased QTc duration (p = 0.001) while molluscum contagiosum coinfection was associated with QTc prolongation (p = 0.02). CONCLUSION In our study, we failed to demonstrate in Mexican population association of QTc prolongation with first- and second-line antiretrovirals. More studies are needed to determine the clinical significance of the effect of raltegravir and molluscum contagiosum on QTc.

Ergotismo y VIH: el riesgo de la automedicación / Ergotism and HIV: the risk of self-medication

El ergotismo es una complicación bien conocida, aunque poco fre-cuente, asociada a la ingesta de derivados de la ergotamina en dosis habitualmente más altas de las recomendadas. No obstante, también puede presentarse luego del uso de bajas dosis cuando se adminis-tran concomitantemente drogas que inhiben su metabolismo, entre ellas los inhibidores de proteasa (IP), ampliamente utilizados en el tra-tamiento de pacientes con infección por el virus de la inmunodeficien-cia humana (VIH). A pesar de esta interacción predecible se siguen observando en la práctica clínica diaria casos de ergotismo, probable-mente debido a que se trata de una droga de uso frecuente, bajo cos-to y que no requiere prescripción médica, sumado a la falta de conoci-miento del paciente de las potenciales interacciones. Se describen las características, diagnóstico, tratamiento y evolución de cuatro pacien-tes con infección por VIH en tratamiento antirretroviral (TARV), basa-do en IP, que presentaron un cuadro de ergotismo

Ergotism is a well-known but rare complication associated with the intake of ergotamine derivatives at doses usually higher than recommended. However, it may also occur after low doses of ergotamine when it is co-administered with drugs that inhibit its metabolism, such as protease inhibitors (PIs), widely used in the treatment of patients with human immunodeficiency virus. Despite this predictable interaction, cases of ergotism are still being observed in daily clinical practice, probably because it is a frequently used, low cost drug that does not require medical prescription, in addition to the patient's lack of knowledge of the potential interactions. We describe here the characteristics, diagnosis, treatment and evolution of four HIV-infected patients on PI-based antiretroviral treatment who presented a clinical picture of ergotism

Antiangiogenic VEGF165b expression in human breast MCF-7 and MCF-10A cells exposed to reverse transcriptase and protease inhibitors / Expresión de VEGF165b antiangiogénico en células MCF-7 y MCF-10A de mama humana expuesto a inhibidores de la transcriptasa inversa y la proteasa

The combined antiretroviral therapy (cART), a multidrug combination regimen, usually consisting Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors, non- Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors and Protease Inhibitors has altered the morbidity pattern affecting HIV-infected individuals to include non-AIDS-defining malignancies (nADMs). The speculation is rife; does cART induce or promote the progression of nADMs such as breast cancer? This study was therefore designed to investigate of the effects of some antiretroviral drugs (at clinically relevant concentrations) on the expression of anti-angiogenic gene; VEGF165b in two human breast cell lines; MCF-7 and MCF-10A by Real Time qPCR and immuno-fluorescence. All of the antiretroviral drugs and combinations tested produced patterns of slight up or downregulation of VEGF165b mRNA expression but the alterations did not attain statistical significance. They also did not alter VEGF165bprotein localisation in both cell lines. The findings reported here suggest that antiretroviral drugs probably do not influence the angiogenic pathway in the development of breast cancer in patients under the combined antiretroviral regimen.

El tratamiento antirretroviral combinado (TARc), un régimen de combinación de múltiples fármacos, consistiendo generalmente en inhibidores nucleósidos de la transcriptasa reversa, inhibidores no-nucleósidos de la transcriptasa reversa e inhibodres de proteasa que alteran el patrón de mortalidad que afecta a infectados por el VIH incluyendo neoplasias definidas como no HIV (nADMs). La especulación es moneda corriente; TARc induce o promueve la progresión de nADMs como cáncer de mama? Por lo tanto, este estudio se diseñó para investigar los efectos de algunos de los fármacos antirretrovirales (en concentraciones clínicamente relevantes) sobre la expresión del gen anti-angiogénico; VEGF165b en dos líneas celulares de mama humana; MCF-7 y MCF-10A por PCR tiempo real e inmunofluorescencia. Todos los fármacos antirretrovirales y las combinaciones probadas pueden regular en forma ligera hacia arriba o hacia abajo la expresión de ARNm producidos por VEGF165b pero las alteraciones no fueron estadísticamente significativos. Además, no se alteran los niveles de proteína VEGF165b, para la localización en ambas líneas celulares. Los resultados aquí presentados sugieren que los medicamentos antirretrovirales probablemente no influyen en la vía angiogénica en el desarrollo del cáncer de mama en pacientes bajo el régimen antirretroviral combinado.

Virus de inmunodeficiencia humana: ¿estado de hipercoagulabilidad? Presentación de dos casos / Is AIDS a prothrombotic entity? Report of two cases

La infección por VIH ha sido reconocida en la actualidad como una condición protrombótica, reportándose en pacientes con SIDA 10 veces mayor riesgo de desarrollo de eventos tromboembólicos de los sistemas arterial y venoso; la literatura reciente ha estimado una incidencia entre el 0.26% y 7.6 %; dicha incidencia se describe asociada a infecciones. oportunistas y/o malignidades. Una variedad de mecanismos potenciales relacionados con factores del hospedador, el virus y el TARV (tratamiento antiretroviral), están implicados en el estado de hipercoagulabilidad en pacientes con SIDA, cuya fisiopatología conduce a alteraciones en la respuesta inflamatoria y de la cascada de coagulación que no han sido bien dilucidadas; sin embargo, incluye la presencia de anticuerpos anticardiolipinas, disminución de anticoagulantes naturales, y otros factores independientes que en conjunto originan morbi-mortalidad creciente si dicha predisposición a eventos trombóticos no es reconocida por el médico. Los autores de este artículo describen 2 casos de eventos trombóticos en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia humana hospitalizados en el Servicio de Medicina Interna de Hospital Universitario de Caracas(AU)

AIDS infection has now been recognized as a prothrombotic condition reported in patients with this disease, and have been found 10 times at greater risk of developing thromboembolic events with systemic involvement. Recent literature has estimated an incidence between 0.26% and 7.6%, also described in association with opportunistic infections and / or malignancies. A variety of potential mechanisms related to host factors, virus and antiretroviral therapy (ART) are implicated in the hypercoagulability status in HIV-positive patients, the pathophysiology leading to alterations in the inflammatory response and the coagulation cascade. It has not been well understood and includes the presence of anticardiolipin antibodies, reduction of natural anticoagulants, and other independent factors that lead to increased morbidity and mortality if such predisposition to thrombotic events is not recognized by the clinician. The authors of this article describe 2 cases of thrombotic events in patients with human immunodeficiency syndrome hospitalized in the Hospital Universitario of Caracas, Venezuela(AU)

Determinación del contenido extra e intracelular de algunas enzimas líticas relacionadas con pared celular en raíces de clavel (Dianthus caryophyllus L.) / Determination of extra and intracellular lytic enzymes related with carnation (Dianthuscaryophyllus L.) root cell wall / Determinação do conteúdo extra e intracelular de algumas enzimas líticas relacionadas com a parede celular em raízes de cravo (Dianthus caryophyllus L.)

En el presente trabajo se verificó la presencia de algunas enzimas relacionadas con la pared celular vegetal (poligalacturonasa, pectato liasa, proteasa y xilanasa) en raíces de clavel (Dianthus caryophyllus L.). Así mismo, se determinaron los niveles de actividad de las mismas. Estos niveles se analizaron en diferentes espacios celulares: en el fluido intercelular que hace parte del apoplasto, en el simplasto y en el tejido total de las raíces de clavel (apoplasto y simplasto). Para extraer el fluido intercelular, se ensayaron dos metodologías. Para obtener el contenido intracelular (simplasto) y el extracto total (apoplasto y simplasto) en raíces de clavel se ensayaron tres metodologías que utilizaban como solución i) extractante buffer fosfato, ii) buffer fosfato con PVPP y iii) lavados con acetona a las raíces de clavel, antes de la extracción con buffer fosfatos. Los resultados mostraron el efecto de las diferentes soluciones en las actividades enzimáticas y en el contenido de proteína. Se propuso una de estas metodologías para extraer las cuatro enzimas en un único paso y realizar análisis comparativo de actividad enzimática.

The presence of some enzymes related to cell wall (polygalacturonase, the pectate lyase, protease and xylanase) in carnation (Dianthus caryophyllus L.) roots as well as the activity levels were determined. These levels were analyzed in different cellular places: the intercellular fluid that is part of the apoplast, the symplast, and the total level (apoplast and symplast) in carnation roots. Two methods were tested to extract the intercellular fluid. To obtain the intracellular content (symplast) and total extract (apoplast+symplast), three methods were tested, using as extracting solution i) phosphate buffer, ii) phosphate buffer + PVPP, iii) before the extraction with phosphate buffer, the carnation roots were washed with acetone. The results showed the effect of different extracting solutions in the enzymatic activities and in the protein content. A new only one step method is proposed to extract the four enzymes and make the comparative analysis of enzymatic activity.

No presente trabalho foi evidenciada a presença de algumas enzimas relacionadas com a parede celular vegetal: poligalacturonasa, pectato liasa, proteasa e xilanasa e se determinaram seus níveis de atividade, em raízes de cravo (Dianthus caryophyllus L.). Os níveis se analisaram em diferentes espaços celulares: no fluido intercelular que faz parte do apoplasto, no simplasto e no tecido total das raízes de cravo (apoplasto e simplasto). Foram avaliadas duas metodologias para extrair o fluido intercelular. Para obter o conteúdo intracelular (simplasto) e o extrato total (apoplasto e simplasto) se avaliaram três metodologias que utilizavam como solução extratora i) buffer fosfato, ii) buffer fosfato com PVPP e iii) lavados com acetona às raízes de cravo, antes da extração com buffer fosfato. Os resultados mostraram o efeito das diferentes soluciones nas atividades enzimáticas e no conteúdo de proteína. Se propõem uma de estas metodologias para extrair as quatro enzimas num único passo e realizar a analise comparativa da atividade enzimática.

Estandarización de un método espectrofluorométrico para medición de proteasa aspártica secretada (Sap) de Candida albicans / Standarization of a spectrofluorometric method to measure secreted aspartic protease (Sap) from Candida albicans

Introducción: la proteasa aspártica secretada (Sap) es considerada un factor de virulencia en el proceso de infección por Candida albicans. La frecuencia de candidiasis a nivel mundial aumenta cada día, razón por la cual se hace necesario encontrar nuevos medicamentos que combatan esta enfermedad, al mismo tiempo desarrollar métodos que evalúen en forma rápida compuestos inhibidores de Sap. Objetivo: estandarizar un método fluorescente para identificar la inhibición de actividad de Sap. Métodos: se indujo la producción de Sap en cultivos de C. albicans según la metodología descrita por Capobiancoy se evaluaron sus niveles por electroforesis en geles SDS-PAGE en diferentes lapsos de tiempos. La actividad de Sap fue verificada por espectrofluorometría, para lo cual se determinaron las condiciones de reacción, variando las concentraciones de cobre y fluorexon, y los resultados de inhibición, se expresaron como disminución en la señal de fluorescencia. Como control de inhibición de Sap se utilizó Pepstatin A y como control positivo de actividad proteasa se utilizó pancreatina. Resultados: se establecieron concentraciones de 5,5 y 5,0 µM para fluorexon y cobre respectivamente; el tiempo óptimo de acoplamiento de estos fue de 120 min y la mayor actividad de Sap se alcanzó a las 22 h de incubación. Conclusiones: las condiciones estandarizadas para el método espectrofluorométrico, permiten confirmar la inhibición de Sap por Pepstatin A y demostrar que es un método viable para evaluar inhibidores de esta proteasa(AU)

Introduction: the Secreted Aspartyl Protease (Sap) is considered a virulence factor in the infection process caused by Candida albicans. The frequency of candidiasis worldwide is increasing, hence the need for finding new drugs to fight this illness and also a quick and economic evaluation and screening methods to identify some Sap inhibition agents. Objective: to standardize fluorescent method for identifying the Sap activity inhibition. Methods: Sap production was induced in C. albicans cultures following the methodology described by Capobianco, their levels were evaluated by electrophoresis on SDS-PAGE gels at different periods of time. Sap activity was checked by spectrofluorometry, for which the reaction conditions were determined, varying the concentrations of copper and fluorexon, and the inhibition results were expressed as decreased fluorescence signal. Pepstatin A served as Sap inhibition control whereas pancreatin was the positive control of the protease activity. Results: the concentration rates of 5.5 µM and 5.0 µM were found for fluorexon and copper, respectively; their optimal coupling times was 120 min and the maximum Sap activity was observed after 22 h of incubation. Conclusions: the standardized conditions for the spectrofluorometric method allowed confirming the inhibition of Sap by Pepstatin A and showing that this is a viable method to evaluate inhibitors of this protease(AU)

Efectividad de la terapia triple antirretroviral en lactante menor con diagnóstico de SIDA categoría C / Effectiveness of triple antiretroviral therapy in a young infant diagnosed with AIDS category C

La falta de medicación antirretroviral durante el embarazo, la no aplicación del protocolo de prevención perinatal del VIH-1 y VIH-2 (PACTG 076) en el momento de la cesárea y la administración de inhibidores de la transcriptasa inversa al recién nacido, es la respuesta más directa a la falta de acciones de protección para los niños (as) que nacen de sus progenitoras que se encuentran viviendo con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En el caso de la nena de 4 meses de edad que nace de un vientre donde se encontraba el presente el VIH, presentan una evolución clínica, inmunológica y virológica que progresivamente la va llevando al estado de caquexia, además de presentar procesos infecciosos secundarios a oportunistas, que se complican con una sepsis determinando la necesidad de ventilación asistida. La administración de forma inmediata de los antirretrovirales (ARV) recomendados por el Programa Nacional de Lucha Contra el VIH/SIDA, sin incluso contar con resultados de carga viral materna, tampoco de la pacientita se asocia dos inhibidores nucleótidos de la transcriptasa inversa, con un inhibidor de la transcriptasa inversa no nucleósido, y los antimicóticos y antimicrobianos adecuados, la respuesta clínica, celular es satisfactoria, así ocurrió con la lactante menor que tratamos. Es cierto que nuestra preferencia es hacer asociaciones con principios químicos de mejor acción sobre este virus, como en nuestro caso ante la evidencia de que la nevirapina nos produjo al quinto día de tratamiento una reacción de alergia (la literatura relata que los casos de esta naturaleza generalmente evolucionan a la muerte), habiéndose además asociado antihistamínicos por vía venosa, y la administración de un inhibidor de la proteasa viral que también es un químico asociado (lopinavir + Ritonavir), habiéndose obtenido una respuesta espectacular, a pesar del fondo de caquexia en que se encontraba la lactante menor de 4 meses de edad. Todo estos acontecimientos de ver cada día más casos de mujeres embarazadas que se enteran de ser portadoras de este virus cuando sus bebes evolucionan atípicamente y/o se encuentran en situaciones clínicas gravísimas, tendrían un mejor pronóstico si se decidiera considerar al VIH/SIDA como el problema de salud número uno en nuestro país.

The lack of antiretroviral medication during pregnancy, failure to apply the protocol perinatal HIV-1 and HIV-2 (PACTG 076) at the time of cesarean delivery and administration of inhibitors of reverse transcriptase newborn is the more directly to the lack of protective actions for children (as) that arise from their mothers who are living with human immunodeficiency virus (HIV) response. In the case of the baby 4 months of age born from a womb where HIV was present, present a clinical, immunological and virological evolution is progressively moving the state of cachexia, besides presenting secondary to opportunistic infectious processes which are complicated by sepsis determining the need for assisted ventilation. The administration immediately antiretroviral (ARV) recommended by the National Programme for the Fight Against HIV/AIDS, without even having maternal viral load results, either of two nucleotides pacientita reverse transcriptase inhibitors dela associated with an inhibitor of non-nucleoside reverse transcriptase and appropriate antifungal and antimicrobial, clinical, cellular response is satisfactory, so it happened with the lowest infant who try. It is true that our preference is to make partnerships with chemical principles of best action on this virus, as in our case given the evidence that nevirapine we came on the fifth day of treatment an allergic reaction (literature reports that cases of this nature death usually evolve), having further associated antihistamines intravenously, and administration of a viral protease inhibitor which is also an associated chemical (lopinavir + ritonavir), a dramatic response being obtained, despite the background of cachexia that infants under 4 months of age was. All these events to see more and more cases of pregnant women who learn to be carriers of this virus when their babies evolve atypically and / or are in very serious clinical situations, would have a better prognosis if it decides to treat HIV/AIDS as the number one health problem in our country.

Protease inhibitor and metabolic alteration / Inhibidor de la proteasa y alteraciones metabólicas

Protease inhibitors (PIs), part of HAART (Highly Active Antiretroviral Therap) are selective, competitive inhibitors of protease, a crucial enzyme to viral maturation, infection and replication. A lipodystrophic syndrome has been reported in individuals treated with HAART, and associated to hyperglycemia, hypercholesterolemia, hypertrigliceridemia, hyperlipidemia, hypertension and hypreinsulinemia. The HAART-associated metabolic abnormalities were first associated with protease inhibitors, Ritonavir mostly, but the mechamisns that underlie these metabolic alterations are to date, not completely understood. Since PIs are candidate to be the drug of choice for other diseases treatment, such as the Hepatitis C, malaria and some types of cancer, it seems to be important to clarify the metabolic alterations associated to PIs. Wistar rats were treated twice a week with 30mg/kg Ritonavir for 4 and 8 weeks. Total cholesterol, HDL, LDL, VLDL, triglycerides and glycemic levels were measured by the end of each period of time selected. To avoid confunding effects of food intake, the animals were fasted 16 hours before. Our results showed rapid increase in serum triglycerides, total cholesterol, LDL-C and glycemic levels. No significant differences were observed for HDL-C or VLDL serum levels. Our study addresses the importance to observe the possible family history of dyslipidemia or diabetes, and control any other cardiovascular and diabetes risk factors when using protease inhibitors.

Los inhibidores de la proteasa (IP), que forman parte de la terapia HAART (terapia antirretroviral altamente activa), son inhibidores selectivos y competitivos de la proteasa, enzima crucial para la maduración, infección y replicación viral. Un síndrome lipodistrófico, asociado a hiperglucemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, hipertensión e hiperinsulinemia, ha sido relatado en pacientes tratados con HAART. Las anomalías metabólicas asociadas a la HAART fueron relacionadas, inicialmente, a los inhibidores de la proteasa, principalmente el Ritonavir, pero los mecanismos que relacionados a estas alteraciones metabólicas son poco comprendidos. Dado que los IP son posibles candidatos a fármacos de elección para tratamiento de otras enfermedades, como hepatitis C, malaria y algunos tipos de cáncer, es importante esclarecer las alteraciones metabólicas asociadas a los inhibidores de la proteasa. Ratas Wistar fueron tratadas dos veces por semana con 30 mg/kg de Ritonavir por 4 y 8 semanas. Fueron determinados los niveles de colesterol total, HDL, LDL, VLDL, triglicéridos y glucemia, al final de cada período considerado. Para evitar la interferencia de la ingestión de alimentos en las determinaciones de laboratorio, los animales fueron sometidos a un ayuno previo de 16 horas. Nuestros resultados mostraron un rápido aumento sérico de los niveles de triglicéridos, colesterol total, LDL-C y glucemia. No se observaron diferencias significativas para los niveles séricos de HDL-C o VLDL. Nuestro estudio apunta a la importancia de considerar los posibles antecedentes familiares de dislipidemia o diabetes, y controlar cualquier otro factor de riesgo cardiovascular y de diabetes cuando se utilizan los inhibidores de la proteasa.

Búsqueda y selección de una proteasa fúngica con potencial aplicación en la restauración de documentos históricos en el Archivo de Bogotá / Screening for a fungal protease with potential in the biorestoration of historical valuable documents in Bogota Archive

Se ha buscado y seleccionado sistemáticamente una proteasa que pudiese ser usada en la eliminación "limpia" de encolantes sobre soportes documentales con valor de patrimonio histórico de forma eficiente y económica, a partir de la colección de hongos filamentosos del Archivo de Bogotá. De 74 morfotipos viables evaluados sobre placas selectivas, 32 morfotipos presentaron formación de halos de hidrólisis evidentes sobre placas diferenciales. De ellos, se evaluó el perfil isoenzimático de 8 morfotipos provenientes de muestreos documentales directos y de 2 morfotipos proteolíticos promisorios provenientes de un trabajo previo. Los 10 morfotipos seleccionados fueron representativos de los géneros Penicillium, Stachybotrys, Chaetomium, y Eladia. Luego de inducir la producción de proteasas extracelulares en medios líquidos diferenciales bajo tres fases de fermentación, se realizaron isoelectroénfoques analíticos tendientes a la observación de isoformas en el gradiente de pH establecido (3.0-10.0). Solo los morfotipos 8D (Chaetomium sp.) y 21D (Eladia saccula) presentaron una isoforma alcalina extrema, de puntos isoeléctricos 8.5 y 8.8, respectivamente, susceptible de selección con miras a su purificación y caracterización parcial de forma económica y eficiente. Los demás morfotipos, representativos de los géneros Penicillium sp., y Stachybotrys sp., presentaron unicamente isoformas proteolíticas en el rango acido de pH con puntos isoeléctricos que oscilan entre 4.0 y 5.0.

Studies on a protease as an efficient, environmental friendly and relatively economical remover of residual proteins for historical valuable documents were performed and was selected for this work, from the filamentous fungi collection of the Bogota Archive. 32 morphotypes of 74 evaluated show hydrolytic activities over differential solid media. From them, 8 morphotypes obtained directly from documental samples and representative of the genera Penicillium and Stachybotrys were selected and their isoenzyme profile were tested. Also 2 previous morphotypes with promisorius proteolytic activities and representative of the genera Chaetomium and Eladia were analysed. Extracelullar proteases production was induced in differential liquid media on three fermentation steps and analitycal isoelectrofocusing were performed over pH 3.0-10.0 ranges. Only the morphotypes 8D (Chaetomium sp.), and 21D (Eladia sp.), showed an alkaline isoform with pIs 8.5 and 8.8, respectly, suceptible of selection for its purification and characterization through efficient and economical way. The others morphotypes only showed acid isoforms with pIs in the range of 4.0 and 5.0.

Ergotamina e inhibidores de la proteasa: impacto clínico de las interacciones farmacológicas: presentación de dos casos / Ergotamine and protease inhibitors: clinical impact of drugs interactions: report of two cases

Las interacciones medicamentosas constituyen un factor relevante en lo que a la alteración de la terapéutica se refiere. Dicha importancia debería ser valorada de forma permanente y su detección y prevención deberían constituir dos de los ejes centrales de la actuación del equipo de salud en su ejercicio profesional. La polifarmacia y la automedicación son dos puntos a supervisar. A su vez, la subnotificación al ente regulatorio es una constante que impide la toma de medidas correctivas por parte del mismo. La difusión de alertas y la educación del paciente son medidas fundamentales en este aspecto. Se presentan dos casos que describen el impacto clínico de las interacciones en pacientes ambulatorios.

Drug interactions are a relevant factor as far as the alteration of therapy is concerned. Such an importance should be assessed on an ongoing basis and its detection and prevention should be two of the cornerstones of the health team's performance inpractice. Polypharmacy and self-medication are two points to be monitored. At the same time, the underreporting to the Regulating Entity is a constant that prevents it from taking corrective actions. Warnings dissemination and patient education are key steps at this point. Two cases are presented describing the clinical impact of the interactions on outpatients.

HIV transmitted drug resistance in adult and pediatric populations in Panama / Farmacorresistencia transmitida del VIH en poblaciones adultas y pediátricas en Panamá

Objetivo. Investigar la prevalencia de farmacorresistencia transmitida del VIH en adultos en Panamá mediante un estudio del umbral modificado de la Organización Mundial de la Salud (OMS) e investigar las tasas de resistencia inicial en lactantesseropositivos para el VIH en Panamá.Métodos. En el Instituto Conmemorativo Gorgas, en 47 adultos seropositivos al VIH se efectuó la genotipificación de las mutaciones asociadas con la farmacorresistencia transmitida en los genes de la transcriptasa inversa y la proteasa del VIH-1, según las directrices del estudio umbral de la OMS, modificadas para incluir a las personas ≤ 26 años de edad. Las tasas de prevalencia de las mutaciones farmacorresistentes contra tres clases de fármacos antirretroviral —inhibidores de la transcriptasa inversaanálogos de nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos e inhibidores de la proteasa— se clasificaron en bajas (< 5,0%), moderadas (5,0%–15,0%) o altas (> 15,0%). También se llevó a cabo genotipificación y se calcularonlas tasas de prevalencia de las mutaciones causantes de farmacorresistencia en 25 lactantes.Resultados. En los adultos de Panamá la farmacorresistencia transmitida fue moderada: 6 de 47 adultos seropositivos para el VIH presentaron una o más mutacionesasociadas con farmacorresistencia transmitida. Las mutaciones farmacorresitentes de transmisión horizontal fueron moderadas para los inhibidores de la transcriptasainversa análogos de nucleósidos y los inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos, y bajas para los inhibidores de la proteasa. En Panamá la transmisiónvertical del VIH ha disminuido en el período 2002–2007, pero la prevalenciade la farmacorresistencia del VIH transmitida por vía vertical es moderada (12,0%) y está surgiendo como un problema debido a la cobertura antirretroviral incompletadurante el embarazo...

Objective. To investigate the prevalence of transmitted drug-resistant HIV among adults in Panama by using a modified World Health Organization Threshold Survey (WHO-TS) and to investigate rates of initial resistance among HIV-positive infants in Panama.Methods. At the Gorgas Memorial Institute, 47 HIV-positive adults were genotyped for mutations associated with transmitted drug resistance (TDR) in the reverse transcriptase andprotease genes of HIV-1, according to WHO-TS guidelines, modified to include patients ≤ 26 years old. Prevalence rates for drug-resistance mutations against three classes of antiretroviraldrugs—nucleoside analog reverse transcriptase inhibitors (NRTIs), non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs), and protease inhibitors—were calculated as low (< 5.0%), moderate (5.0%–15.0%), and high (> 15.0%). Twenty-five infant patients were also genotyped and prevalence rates for drug-resistance mutations were calculated. Results. TDR among Panamanian adults was moderate: 6 of 47 HIV-positive adultsshowed one or more mutations associated with TDR. Horizontal TDR mutations were moderate for NRTIs and NNRTIs and low for protease inhibitors. Vertical transmission of HIV inPanama has decreased for 2002–2007, but vertical HIV TDR prevalence is moderate (12.0%) and is emerging as a problem due to incomplete antiretroviral coverage in pregnancy. Conclusions. The prevalence of HIV TDR indicated by this study, combined with knownrates of HIV infection in Panama, suggests more extensive surveys are needed to identify risk factors associated with transmission of HIV drug resistance. Specific WHO-TS guidelines for monitoring vertical transmission of drug-resistant HIV should be established.

Riesgo cardiovascular en el paciente con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana que recibe tratamiento antirretroviral / Cardiovascular risk in patients with human immunodeficiency virus infection receiving

Con el advenimiento de la terapia antirretroviral, los pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana viven más tiempo y con mejor calidad de vida. Sin embargo, estudios epidemiológicos recientes sugieren un aumento del riesgo de enfermedad ateroesclerótica prematura en esta población, especialmente si reciben algún inhibidor de la proteasa, dentro de su esquema de tratamiento. Se realiza un estudio epidemiológico, observacional, analítico, transversal, para establecer el riesgo cardiovascular clínico, bioquímico e imaginológico en pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana, procedentes del Complejo Hospitalario Universitario Ruiz y Páez, Ciudad Bolívar, octubre 2008–2010. Se evaluaron 119 pacientes, con edad media de 42 años. El 52% recibió algún inhibidor de la proteasa. El 69% fueron hombres. Los pacientes que recibieron un inhibidor de la proteasa presentaron en promedio valores de presión arterial en el rango normal alto. Los valores de colesterol total estuvieron dentro de lo normal. Se observó una media muy baja de colesterol HDL independiente del esquema de tratamiento. La frecuencia de tabaquismo fue de 47%. La presencia de diabéticos osciló entre 1,75% y 3,22%. Los pacientes que recibieron inhibidor de la proteasa tuvieron mayor porcentaje de riesgo cardiovascular según el Framingham Risk Score. Según los valores de la proteína C reactiva ultrasensible ningún paciente presentó riesgo bajo y el 77,32% presentó riesgo alto. El grosor intima-media carotideo estuvo aumentado en el paciente con inhibidor de la proteasa (P=0,003). Se estableció asociación entre un riesgo clínico moderado y un grosor intima-media carotideo superior al percentil 50 (P<0,001, OR=7,04, IC 95%=2,97-16,68). La presencia de grosor-media carotideo aumentado cuando el riesgo es moderado, obligaría a la re-estratificación y por ende al tratamiento intensivo de los factores de riesgo en esta población.

With the advent of antiretroviral therapy or HAART, patients with HIV/AIDS live longer and had better quality of life. However, recent studies suggest increased rates of premature atherosclerotic disease in this population, especially if they receive a regimen with a protease inhibitor. An epidemiologic, observational, analytic, prevalence study was conducted to establish cardiovascular risk using clinical, laboratory and imaging techniques, in patients with HIV/AIDS receiving HAART, from the Hospital Universitario Ruiz y Páez, Ciudad Bolívar, october 2008-2010. 119 patients were evaluated. Average age was 42 years. 52% of the patients received a protease inhibitor. 69% were men. Patients receiving a protease inhibitor were pre-hypertense. Cholesterol values were within normal. There was a very low average of HDL-cholesterol. The frequency of current smoking was 47%. The presence of diabetes was 3.22%. Patients receiving protease inhibitor had a higher percentage of cardiovascular risk according to Framingham Risk Score. No patient had low risk by CRP values, while 77.32% had a high risk. This trend was observed equally in both groups. The carotid intima-media thickness in patients with HIV with protease inhibitor was increased (P=0,003). There were association between moderate and high clinical risk and carotid intima-media thickness above the percentile 50 (P<0.001, OR=7.04,95% CI=2.97 to 16.68). The presence of increased carotid intima-media thickness when the risk is moderate, would require the re-stratification and hence intensive treatment of risk factors in this population.

Seleção de basidiomicetos proteolíticos / Selección de basidiomicetos proteolíticos / Selection of proteolytic basidiomycetes

Basidiomicetos têm sido amplamente utilizados como produtores de enzimas, no entanto são pouco explorados quanto a sua capacidade de produção de proteases. Estes fungos são reconhecidos pelas suas propriedades antitumorais, hipocolesterolêmicas, antimutagênicas, antioxidantes entre outras. Assim, a associação destas propriedades aos derivados do leite pode potencializar estes produtos como alimentos funcionais. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi selecionar basidiomicetos produtores de proteases, com potencial uso no processo de fabricação de derivados do leite. Foram utilizadas 27 linhagens de fungos crescidas em meio mínimo adicionado de 0,2% de caseína. A atividade proteolítica foi verificada pela formação de halo pela adição de uma solução saturada de (NH4)2SO4. Concluiu-se que a produção de proteases não apresenta relação com o crescimento micelial. O melhor produtor de proteases é a linhagem Lentinula edodes U8/1, seguida por Pleurotus sp (U2/9, U6/10 e U2/11). Os basidiomicetos Agaricus blazei (U4/3), Agaricus sp (U5/1), Flamulina sp (U5/4), Lycoperdon sp (U8/8), Agaricus blazei (U2/7), Agaricus blazei (U7/2), Agaricus blazei (U7/4) e Agaricus blazei (U7/5) não produzem proteases suficientes para serem medidas pela metodologia. Desta forma, estes resultados embasam o uso de Lentinula edodes e Pleurotus sp para o desenvolvimento de potenciais aplicações na hidrólise de proteínas em alimentos.

Basidiomycetes have been widely used as enzyme producers, but are poorly explored about their ability to produce protease. These fungi are known as antitumor, cholesterol-lowering, antimutagenic, antioxidant among other biological activities. Thus, the combination of basidiomycete properties to dairy products can improve them as functional foods. Therefore, the objective of this work was to screen basidiomycete protease producers to prospect the use of these fungi on dairy products. 27 basidiomycete strains grown on minimal medium supplemented with 0.2% casein were used. The proteolytic activity was verified by halo formation after a (NH4)2SO4 saturated solution addition on the culture medium. The production of proteases is not associated with mycelial growth. The best producers of proteases is Lentinula edodes U8/1 and after Pleurotus sp (U2/9, U6/10 e U2/11). The basidiomycetes of Agaricus blazei (U4/3), Agaricus sp (U5/1), Flamulina sp (U5/4), Lycoperdon sp (U8/8), Agaricus blazei (U2/7), Agaricus blazei (U7/2), Agaricus blazei (U7/4) and Agaricus blazei (U7/5) do not produce enough proteases to be measured by the methodology. Thus, these results support the use of Lentinula edodes and Pleurotus sp as potencial basidiomycetes for protein hydrolysis on food.

Basidiomicetos han sido ampliamente utilizados como productores de enzimas, pero poco exploradas en su capacidad de producción de proteasa. Estos hongos son reconocidos por sus propiedades antitumorales, reductor de colesterol, antimutagénicos, antioxidantes entre otras. Así, la asociación de estas propiedades a los derivados de la leche puede potencializar estos productos como alimentos funcionales. En este sentido, el objetivo de este trabajo fue seleccionar basidiomicetos productores de proteasas, con potencial uso en el proceso de fabricación de productos lácteos. Se utilizó 27 cepas de hongos crecidos en medio mínimo adicionado de 0,2% de caseína. La actividad proteolítica fue verificada por formación de halo por la adición de solución saturada de (NH4)2SO4. Se concluyó que la producción de proteasas no presenta relación con el crecimiento del micelio. El mejor productor de proteasas es la cepa de Lentinula edodes U8/1, seguida por Pleurotus sp (U2/9, U6/10 y U2/11). Los basidiomicetos Agaricus blazei (U4/3), Agaricus sp (U5/1), Flamulina sp (U5/4), Lycoperdon sp (U8/8), Agaricus blazei (U2/7), Agaricus blazei (U7/2), Agaricus blazei (U7/4) y Agaricus blazei (U7/5) no producen proteasas suficientes para que sean medidos por la metodología. Por lo tanto, estos resultados apoyan el uso de Lentinula edodes y Pleurotus sp para el desarrollo de potenciales aplicaciones en hidrólisis de proteínas en alimentos.

Production of an extracellular protease by an Antarctic bacterial isolate (Bacillus sp. JSP1)as a potential feed additive / Proteasa extracelular de un aislado bacteriano Antartico (Bacillus sp. JSP1) con uso potencial como aditivo alimenticio para animales / Produção de proteasa extracelular por bactérias antárcticas isoladas, Bacillus sp. JSP1 como um aditivo potencial em concentrado

Extracellular proteolytic activity was found in JSP1, an Antarctic bacterial isolate. The strain was related to Bacillus sp, based on 16S rRNA gene sequence analysis. The JSP1 protease was partially purified by ammonium sulfate precipitation. Optimal enzyme activity occurred at 40 C and pH 7.4. Enzyme activity was significantly enhanced in the presence of Mg2+ and Ca2+ and was completely inactivated in presence of Cu2+, Zn2+, Hg2+, EDTA and SDS. The enzyme hydrolyzed casein the most effectively among the protein substrates tested. The enzyme also exhibited relatively high activity on keratin and gluten, and was active against peptidyl conjugates such asL-Leu-p-Nitroanilide and N-Succinyl-L-Phe-p-Nitroanilide. This study suggests that JSP1 protease could be utilized as a potential environmentally-friendly feed additive in animal production.

Se reporta haber encontrado actividad proteolítica extracelular en una bacteria antártica denominada JSP1. Con base en el análisis de secuencia genética 16S ARNr, la cepa fué relacionada con Bacillus sp. La proteasa JSP1 fué parcialmente purificada por precipitación con sulfato de amonio. La actividad óptima de la enzima se produjo a 40 ºC y pH 7,4. La actividad enzimática fue significativamente mayor en presencia de Mg2+ y Ca2+ y se inactivó completamente en presencia de Cu2+, Zn2+ , Hg2+ , EDTA y SDS. Entre todos los sustratos ensayados, el más eficientemente hidrolizado por la enzima fue la caseína. La enzima tuvo actividad relativamente alta sobre la queratina y el gluten, y participó activamente contra conjugados peptídicos como la L-Leu-p-nitroanilida y la N-succinil-L-fenilalanina-p-nitroanilida. La enzima podría ofrecer potencial para su uso como aditivo alimenticio ecológico en producción animal.

A actividade proteolítica extracelular foi encontrada a partir de uma bactéria antárctica denominada JSP1, mediante uma análises de sequencia do gene 16S rRNA, a cepa foi relacionada para Bacillus sp. A proteasa JSP1 foi parcialmente purificada por precipitação com sulfato de amônia. Uma óptima actividade enzimática ocorreu em 40 ºC e pH 7,4. A actividade da enzima foi significativamente maior na presença de Mg2 + e Ca2 +, e foi completamente inactivada em presença de Cu2 + Zn2 +, Hg2 +, EDTA e SDS. A enzima hidrolisada de caseína foi mais eficaz entre os substratos de proteína testados, apresentando maior actividade na queratina e no glúten e foi activo contra os peptidil conjugados como L-Leu-p Nitroanilida e N-succinil-L-Phe-p-Nitroanilida. A enzima pode ser utilizado como aditivo ambiental na alimentação animal.

Prueba cuantitaiiva para proteasas usando películas fotográficas / Quantitative Protease Assay Using Photographic Films

Se han desarrollado dos métodos para la medición cuantitativa de la actividad proteasa basados en la prueba de la película fotográfica. Una prueba discontinua puede ser implementada mediante la cuantificación de la cantidad de pigmento remanente en la película con cualquier programa de edición de imágenes. La medición continua de la actividad proteasa se puede obtener a través del cambio de absorbancia generado por la liberación de las sales de plata unidas al negativo fotográfico si se cuenta con un espectrofotómetro equipado con una celda con agitación.

Two quantitative protease assays have been developed based on the classic photographic film test. A discontinuous assay can be performed by measuring the amount of pigment remaining in the film with any image editor software. A continuous assay can be implemented by the measuring the release of silver halide salts bonded in the film using a recording spectrophometer equipped with a Peltier Cell.

Aplicación de eddopeptidasa alcalina en carnaza bovina para mejorar la calidad de la gelatina / Aplication of allkaline endopeptidase in bovine hide to improve the quality of the gelatine / Aplicaço da endoopeptidse alcalina na pele bovina para melhorar a quallidade da gelatina

El precio de la gelatina en el mercado internacional está determinado por sus propiedades físico-químicas que dependen a su vez de la materia prima, de la forma de extracción del colágeno y de su método de concentración. En este estudio, utilizando procesos de producción en planta piloto de gelatina tipo B, se evaluó el efecto de la aplicación de una endopeptidasa alcalina en el pretratamiento de tres tipos de carnaza bovina sobre la calidad final de la gelatina medida como bloom , viscosidad y claridad. Los resultados se compararon con procesos en los cuales se utilizaron las mismas materias primas sin pretratamiento enzimático. Los análisis estadísticos mostraron diferencias significativas entre los tratamientos. Los mejores resultados de bloom , viscosidad y claridad se presentaron utilizando la enzima en el pretratamiento de la carnaza entera; en trece horas de proceso se obtuvo el 61,5% de la gelatina con bloom alto superior a 300 g , el 51,3% con viscosidades altas mayores de 42 mp y el 82,1% con claridades altas menores de 39 unidades nefelométricas de turbidez. La carnaza entera sin pretratamiento enzimático presentó el 41% de valores altos de bloom , el 7,7% de viscosidades altas y el 76,9% de claridades altas .

The international market price of gelatine is determined by its physical-chemical properties, that depend on the raw material, the collagen extraction method and the concentration method. In this work, using class B gelatine production processes in pilot plant, the effect of application of alkaline endopeptidase was evaluated in the pre-treatment of three types of bovine hide on the gelatine final quality as measured by bloom, viscosity and clarity. The results were compared with processes in which the same raw materials were used without enzymatic pre-treatment. The statistical analysis showed significant differences among the treatments. The best bloom, viscosity and clarity results were presented using enzymatic pre- treatment in the whole hide, obtained in thirteen hours of process 61.5% of the gelatine with bloom higher than 300g, 51.3% with viscosities values higher than 42 mp and 82 ,1 % with high clarities value, with values lower than 39 nephelometric turbidity units. The whole hide without enzymatic pre-treatment showed 41% of high values of bloom, 7.7% of high viscosities and 76.9% of high clarities .

O preço da gelatina no mercado internacional é determinado pelas suas propriedades físico-químicas as quais dependem da matéria-prima, da forma de extração do colágeno bovino e do método de concentração. Neste estudo, utilizando processos de produção em planta piloto de gelatina tipo B, foi avaliado o efeito da aplicação da protease alcalina no pré-tratamento de três tipos de pele bovina sobre a qualidade final da gelatina determinada como bloom , viscosidade e transparência. Os resultados foram comparados com processos nos quais se utilizaram as mesmas matérias-primas sem pré-tratamento enzimático. As análises estatísticas mostraram diferenças significativas entre os tratamentos. Os melhores resultados de bloom , viscosidade e transparência foram obtidos utilizando protease alcalina no pré-tratamento da pele inteira, se obtendo em treze horas do processo o 61,5% de gelatina com bloom alto superior a 300 g , o 51,3% com viscosidades altas maiores a 42 mp e o 82,1% com transparências altas menores a 39 unidades nefelométricas de turbidez . A pele inteira sem pré-tratamento enzimático apresentou o 41% dos valores altos de bloom , o 7,7% de viscosidades altas e o 76,9% de transparências altas.